讓糖化後的麥芽汁（wort）生成酒精的第一步驟，就是「發酵」（fermentation）。首先，要將經過熱交換器降溫後的麥芽汁，放入「發酵槽」（washback）中。常見的發酵槽材質有木製、鑄鐵製、不鏽鋼製…等，其中不鏽鋼製的發酵槽可說是20世紀的重大發明，較能防止細菌產生，在清潔上也更為方便，並且降低了化學清潔劑的使用。
麥芽汁進到發酵槽後，緊接著要加入酵母菌（yeast）。酵母菌為一種單細胞真菌，能夠將糖分發酵，生成酒精。而酒廠用來發酵的酵母菌為釀酒酵母（學名：Saccharomyces cerevisiae），又稱麵包酵母或啤酒酵母。不僅釀酒，製作麵包、饅頭…等食品也都會用到釀酒酵母。
- 化學式：C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2+ 2ATP
- 文字式：醣類（葡萄糖、果糖或蔗糖）→醇類（乙醇）+二氧化碳+能量
以上化學式與文字式說明了麥芽汁裡的糖分轉化成酒精的過程。在缺乏氧氣時，釀酒酵母會進行缺氧呼吸作用，當中通過糖酵解作用將葡萄糖轉化成丙酮酸，其後丙酮酸經脫碳作用脫去碳原子，形成乙醛，同時釋出二氧化碳CO2，乙醛再被於糖酵解作用產生的NADH2還原成乙醇並產生能量（ATP）。而乙醇的俗稱就是酒精。
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